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，邀请高校、科研院所公共技术平台的老师分享技术心得和经验，方便生命科学领域研究人员了解有关技术进展，学习仪器使用方法。本篇由上海科技大学生命学院分子影像平台主任李晓明博士撰写，她根据多年工作经验，总结并分享了较厚样品成像策略。以下为供稿内容：导语：技术是科学发展的重要推动力，这点在生命研究中也慢慢变得得到凸显。但是在实际研究中我们应该注意一个基本原则：平台技术人需要为样品寻找合适的成像方法或仪器，而非为某些方法或仪器寻找合适的研究样品。我们这次以较厚生物样品为例来说明生命科学工作的人们的多样化和多层次的需求，同时也期待仪器研发者们向应用型更强的方向发展。
由于具有非侵入无损、可进行多色特异性成像等特点，光学成像技术一直在生命研究中具有广泛的应用。随着现代荧光成像技术的发展，共聚焦显微镜和各种超高分辨率显微镜慢慢的变成了各大生物实验室的必备工具。常见的生物成像技术主要是针对贴壁细胞或较薄组织切片（≤50μm）而设计，研究人能很容易地使用这一些主流显微镜的常规配置半自动地实现实验目的。
随着研究的深入，研究者们发现体外培养的贴壁细胞无法较好地表现复杂的体内细胞应答和相互作用等重要生物机制，而较薄的切片也经常会破坏一些完整的细胞或组织架构。最近几年慢慢的变多的科学家不再满足于研究上述常规样品，将研究延展到类器官、小模式动物、包含更多完整结构的生物器官或其较厚切片样品等领域。研究者们发现使用主流显微镜的常规配置对这些样品进行观察成像时，结果很多时候都不尽如人意。在这类成像实验中我们大家常常会面临三个层次的难题：
我们先从第一个问题出发，讨论怎么样才可以观察到样品较深部位将的信号，将生物研究者的需求拆解为对成像设备的需求。
信号怎么样才可以被看到？这样的一个问题在荧光成像中其实是一个复合题，它包括几个维度：首先待检测荧光素可以被激发和检测，即激发光和检测光波长范围要与所选仪器适配；其次，仪器的信号检验测试能力要够深，即使用的物镜工作距离要足以检测到信号所在的深度；然后，信号也要够亮，足够的信噪比是所有信号和背景能够区分的前提；最后，深层的信号要突出出来，不能被其他层有几率存在的或明或暗的信号所掩盖。所以，如果想要对较厚组织进行清晰成像确实很复杂，相当于在深山老林中去摘一棵指定的大树上的指定颜色的树叶。
生命科学中使用的物镜工作距离范围从用于体视显微镜物镜的 50 mm到用于高功率油浸物镜的小于 0.1 mm。它通常随着放大倍率、数值孔径（高数值孔径代表高分辨率和高信号亮度）的增加而降低，相应的结果是长工作距离的物镜常常要牺牲检验测试灵敏度和分辨率。即使对于相同放大倍率的物镜，工作距离也会因制造商或者产品系列的不同而不同。
与传统物镜相比，长工作距离物镜可校正由于距离较长而发生的像差，是专为在更长的工作距离下聚焦而设计的专用物镜，它们工作距离通常是常规数值孔径可比物镜工作距离的两到三倍。但是这类物镜通常没办法做到复消色差，即紫外光与其他常用荧光有极大几率会出现色差。应用于光片显微镜和双光子显微镜的特殊物镜具有更长的工作距离及更高的数值孔径，但是这种物镜的净身长度与常规显微镜主机并不匹配。另外，对于不够透明的样品而言，由于球差畸变产生的光散射影响，实际的工作距离会受一定的影响。对于大多数应用而言，用户要在工作距离和其他参数之间做出这种选择。
2. 信号亮度/信噪比样品的信号强度和信噪比当然首先和样品本身的特点和制备标记方法有关，但是在实际成像过程中，不同仪器的配置也有不同效果。高灵敏度的检测系统对于较大样品信号采集来说也相当实用，一方面检测系统的较高灵敏度会较大地提高图像采集速度，另一方面也可以产生较低的光毒性和光漂白效果从而保护样品。在常规的图像采集过程中，影响成像设备灵敏度的配置主要是物镜和检测器（当然层切效果也会影响信号亮度，这部分下个小节来讨论）。
数值孔径是物镜选择中最重要的参数，它指的是物镜与样品之间介质的折射率（n）和孔径角（2α）半数的正弦之乘积。数值孔径越大，收集到的信号越多 ，分辨率也越高。而在荧光成像中，物镜或其他变倍器的放大倍数越大，收集到的信号越少。荧光信号检测亮度与物镜的关系也可以简单描述为Brightness ∝ (NA
/M)2，即荧光信号亮度与数值孔径的四次方成正比，与放大倍数的平方成反比。下面表格中展示的是不同参数的物镜对应的明场和荧光的信号亮度。
[1]荧光检测器的进步是近些年光学成像技术发展的重要一环，适合扫描共聚焦和双光子显微镜等设备的点检测器和适合转盘共聚焦、光片显微镜、荧光显微镜等设备的面检测器都取得了很大的进展。
商业化产品中常见的点检测器主要有PMT、GaAsP、APD、HyD系列等，生物学家不必了解其背后的光电原理，但是与其匹配实验需求：即在所需的波长范围内检测器是否灵敏、是否有足够用的动态范围。这些参数在同一商家的同一系列的检测器下都可能不一样，比如PMT和HyD都有不同的子类可选。在常规的可见荧光检测部分，一般来说，GaAsP和HyD系列灵敏度表现更好，量子效率可达到40～60%，但是动态范围比常规PMT稍差，量子效率仅为20～30%。
[2,3]面检测器的种类非常之多，生物成像中常用的主要是CCD、EMCCD、前照式sCMOS和背照式sCMOS等相机。在不同波段的量子效率也是衡量这些相机检测灵敏性的重要参数，图中所示为不同灵敏度相机在相同曝光时间内所得图像对比。一般来说EMCCD和背照式sCMOS具有较高的灵敏性，我们一般选择大于95%的相机做高灵敏度荧光成像。
3. 层切效果虽然客观存在的细胞、组织、器官甚至生物体都是三维的，但是生物学家在很早的时候就意识到，薄切片中比厚样品中更容易看到其中的细致结构。切片机也是生物样品制备中常用的工具，经典的光学成像样品切片通常在100μm以下。然而近年来的研究趋势要求生物学家研究的不单单是截面，更要研究三维的结构。但是这类要求对样品制备和成像技术而言都有相当大的挑战。
[5]在生物研究中，大多数实际样品并不是只有稀疏的信号，样品中不同深度的信号经常对其他层的成像造成干扰，较强的自发荧光也会影响成像。光学切片是适当设计的显微镜可以在厚样品深处产生清晰焦平面图像的过程，光学科学家们设计了几种显微镜技术来提高光学切片的质量。这在某些特定的程度减少了使用切片机等仪器进行薄切片的需要，从而使较厚样品的活细胞成像和获得更加完整的生物结构成为了现实。
在传统的宽场荧光显微镜成像过程中，光切片的效果主要受物镜的景深（焦深）和信号的密集程度影响。物镜景深由最近的聚焦物体平面到同时聚焦的最远平面的距离决定，也能够理解为物镜的z轴分辨率，由物镜的数值孔径决定。高数值孔径物镜比低数值孔径物镜具有更小的景深，即光切片层更薄。但是数值孔径大的物镜一般工作距离较小，即同类物镜的数值孔径越大，可观察样品厚度越薄但z轴分辨率越高（信号亮度也更亮）。另外，对于信号较密集厚样品而言，由于不同层信号的相互干扰，实际的可检测深度和层切效果会比理论值差一些。总之，宽场显微镜的层切厚度较厚，且容易受其他位置或层面的信号干扰。
共聚焦显微镜通过用点光源和针孔的配合，将在物镜焦平面上方和下方的点处发生的与针孔不共焦的大量发射荧光挡掉，从而形成层切效果，再通过不断移动Z轴实现对样品的三维层切并通过三维重构获得样品精确的三维信息。共聚焦一般只能配置常规的物镜，没办法使用数值孔径和工作距离俱佳的特殊长工作距离物镜，成像深度和灵敏度无法兼顾。另外，共聚焦在折射率相对均一的样品中层切效果较好，在不均一样品中，针孔有时会去掉一些错误信息，从而使层切效果变差。
双光子显微镜在光束最聚焦的地方，光子密度才足够高，从而能够使得荧光分子同时吸收2个光子，发射出一个较短波长的荧光。由于信号在在光密度不够高的地方不会被激发，所以双光子显微镜不需要针孔就能轻松实现层切效果。而这种层切效果受样品折射率影响相对共聚焦要小很多，适配样品更多。另外，大多数双光子的配置比较灵活，支持更好效果的长工作距离物镜，也更加有助于这类成像的实现。如果不考虑扫描速度，双光子显微镜的成像深度、检验测试灵敏度和分辨率之间的平衡是最佳的。
[6]光片显微镜的特别之处在于它的激发光照射方式，与传统显微镜不同，它的照明光是与检测光路垂直的片层光，只有焦平面被照亮，样品别的部分不受影响。光片显微镜的设计较为自由，支持成像效果好的长工作距离物镜和快速拍照的相机，能够直接进行非常理想的厚样品成像。但是目前光片显微镜的配套机械化部件还在起步阶段，无法很好的提供活细胞培养的条件和稳定的位置重现，大多数也不支持高通量、多条件的筛药培养容器。另外，每种光片适合的样品大小和分辨率范围都是相对固定的，没有通用型仪器，很有必要针对实际的需求去做仪器选择。
总结和讨论其实，厚样品的概念是相对的。对于研究者而言，所有在所需分辨率的成像模式下（深度）看不到信号的样品都是厚样品。除了上述对绝对意义上的较大成像的方法之外，我们在实际研究中还有一些其他策略。比如，选择工作距离足够但分辨率和信号亮度略缺的传统长工作距离物镜进行荧光显微镜或者共聚焦成像，接着进行反卷积或者某些特定的程度的图像深度学习处理，能够获得相对较为清晰的图像；而选择结构光照明或其他超高分辨率手段也是提高低数值孔径（通常具有更长工作距离）成像分辨率和层切效果的一种重要方式，在大样品成像中大范围的应用（比如fMOST、Aptome等）。
一旦可以检测到较深信号，研究者们通常希望有机会能够在较短时间内实现大样品的三维结构成像。鉴于拍照速度，快速成像往往使用面检测器，而适合的面成像检测器往往需要灵敏的检测效率和快速的快门时间，因此大多数此类研究选择的是背照式、高灵敏度的sCMOS。而使用的仪器也以匹配sCMOS的转盘共聚焦和光片显微镜为主。另外，当相机快门速度足够的时候，用户也一定要考虑样品的移动速度，在Z轴方向上选择压电陶瓷驱动是有必要的。而对需要拼图的样品，机械控制的精确度和稳定能力也及其重要。当然机械和环境控制的稳定性和拍照速度在大样品活细胞成像中也很重要，目前很多应用还在摸索中。
除了上述硬件选择之外，样品制备和数据处理也经常是大样品成像中的重要组成部分，你们可以参考光片显微镜专家的文字部分。
关于上海科技大学生命学院分子影像平台上海科技大学生命学院分子影像平台于2016年建立，旨在建成国内设备先进、仪器使用率高和产出效率高的公共实验室。目前主要为上海科技大学及辐射范围内其他研究单位或高科技产业的科研技术工作者提供高效率、高质量的光学显微镜技术支撑服务，为广大新老用户提供生物成像相关的技术和软件培训等服务。
（7）配备ET-SE、ESB、aBSD和aSTEM检测器的发射扫描电镜成像。
李晓明博士，高级工程师，2013年毕业于中科院上海应用物理研究所，自研究生以来便专注于光学成像在生物中的应用。2016年加入上海科技大学，并负责分子影像平台的组建工作，主要擅长超高分辨率显微镜、活细胞成像技术、高级图像分析等。
杨紫薇博士，高级工程师，2017年毕业于华南农业大学，熟练使用各种超高分辨率显微镜、全内反射显微镜、激光片层显微镜等高端成像设备。
范承玉，工程师，2015年在北京林业大学取得硕士学位，她熟练进行活细胞和大样品成像，擅长生物制图，为学院的论文配图提供了培训和支持。
王瑞，工程师，2020年在上海科技大学取得硕士学位，她熟练使用平台大多数仪器，在类器官成像领域经验比较丰富，也负责平台的电镜工作。
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